فهرست محتوا
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV از اجزای مهم کنترل کیفیت تست‌های مولکولی هستند و به آزمایشگاه کمک می‌کنند مشخص کند که فرایند انجام آزمایش به‌درستی پیش رفته و نتیجه به‌دست‌آمده قابل اعتماد است. کنترل مثبت باید واکنش مورد انتظار را ایجاد کند تا عملکرد صحیح مواد، دستگاه و مراحل تکثیر DNA تأیید شود؛ در مقابل، کنترل منفی نباید سیگنال مربوط به HPV نشان دهد و وجود سیگنال در آن می‌تواند احتمال آلودگی نمونه‌ها، مواد یا محیط کار را مطرح کند.
این دو کنترل برای تفسیر نتیجه بیمار طراحی نشده‌اند، بلکه اعتبار کل Run آزمایش را بررسی می‌کنند. اگر پاسخ هر یک از آن‌ها خارج از محدوده مورد انتظار باشد، ممکن است نتایج نمونه‌های همان نوبت قابل گزارش نباشند و نیاز به بررسی علت خطا یا تکرار آزمایش وجود داشته باشد. معیار پذیرش کنترل‌ها نیز بسته به نوع کیت، روش Real-Time PCR و دستورالعمل سازنده متفاوت است؛ بنابراین ارزیابی آن‌ها باید همواره بر اساس IFU همان کیت انجام شود.
برای کسب اطلاعات و خرید کیت تشخیص جهش Factor V Leiden (G1691A) – Zena Max کلیک کنید.
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV دو جزء کنترلی مهم برای ارزیابی صحت اجرای تست‌های مولکولی هستند که به آزمایشگاه نشان می‌دهند واکنش PCR در شرایط قابل قبول انجام شده است یا خیر. کنترل مثبت معمولاً شامل ماده ژنتیکی هدف یا توالی مشخصی است که باید در واکنش شناسایی شود؛ بنابراین مشاهده پاسخ مورد انتظار در آن، عملکرد مناسب مواد واکنش، دستگاه و فرایند تکثیر را تأیید می‌کند. در مقابل، کنترل منفی فاقد DNA هدف HPV است و نباید سیگنال اختصاصی ویروس ایجاد کند.
بررسی هم‌زمان این دو کنترل کمک می‌کند خطاهایی مانند آلودگی، اشکال در آماده‌سازی واکنش، نقص برخی مواد مصرفی یا اختلال در اجرای تست شناسایی شوند. اگر پاسخ کنترل‌ها مطابق معیار تعیین‌شده توسط سازنده کیت نباشد، اعتبار Run باید دوباره بررسی شود و ممکن است نتایج نمونه‌های بیمار تا زمان رفع مشکل قابل گزارش نباشند.
اصول استفاده از کنترل‌های مثبت و منفی تنها به آزمایش‌های تشخیص HPV محدود نیست و در ارزیابی بسیاری از تست‌های مولکولی اهمیت دارد. برای نمونه، در آزمایش‌های مبتنی بر کیت Factor V Leiden (G1691A) – Zena Max نیز بررسی اعتبار واکنش بر اساس کنترل‌های تعیین‌شده در دستورالعمل سازنده ضروری است.
کنترل مثبت در آزمایش HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در بخش کنترل مثبت با استفاده از نمونه‌ای با هدف ژنتیکی شناخته‌شده، توانایی سیستم آزمایش برای شناسایی صحیح HPV را ارزیابی می‌کند. این کنترل باید طبق محدوده و معیار تعریف‌شده در دستورالعمل کیت، سیگنال مورد انتظار ایجاد کند. مشاهده پاسخ صحیح نشان می‌دهد اجزای اصلی واکنش، از جمله پرایمرها، پروب‌ها، آنزیم‌ها و شرایط تکثیر، توانایی انجام وظیفه خود را داشته‌اند. اگر کنترل مثبت سیگنال مناسب ایجاد نکند، احتمال وجود اشکال در آماده‌سازی واکنش، کیفیت مواد، برنامه دستگاه یا شرایط نگهداری مطرح می‌شود و پیش از گزارش نمونه‌های بالینی باید علت این وضعیت بررسی شود.
کنترل منفی در آزمایش HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در بخش کنترل منفی به آزمایشگاه کمک می‌کند وجود آلودگی ناخواسته در مراحل آماده‌سازی و اجرای تست را شناسایی کند. کنترل منفی به‌گونه‌ای طراحی می‌شود که فاقد توالی هدف مورد بررسی باشد؛ بنابراین در کانال اختصاصی HPV نباید amplification غیرمنتظره مشاهده شود. ایجاد سیگنال در این کنترل می‌تواند احتمال آلودگی متقاطع میان نمونه‌ها، انتقال DNA هنگام پیپتاژ یا آلودگی برخی مواد مصرفی را مطرح کند. در چنین شرایطی، نتیجه Run نباید بدون بررسی پذیرفته شود و لازم است منشأ احتمالی آلودگی، محیط کار، تجهیزات و مواد مورد استفاده ارزیابی شوند.
کنترل مثبت در آزمایش HPV چگونه عمل می‌کند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در بخش Positive Control این امکان را فراهم می‌کند که آزمایشگاه عملکرد کلی سیستم تشخیصی را در شرایط کنترل‌شده ارزیابی کند. کنترل مثبت حاوی هدف ژنتیکی مشخصی است که سیستم آزمایش باید توانایی شناسایی آن را داشته باشد. در صورت اجرای صحیح مراحل، سیگنال مورد انتظار در کانال تعیین‌شده ظاهر می‌شود و نشان می‌دهد بخش‌های اصلی فرایند مانند آماده‌سازی واکنش، عملکرد معرف‌ها، تکثیر هدف و تشخیص فلورسانس مطابق انتظار انجام شده‌اند. با این حال، مثبت شدن این کنترل به‌تنهایی برای تأیید همه نمونه‌ها کافی نیست و باید نتیجه سایر کنترل‌های همان Run نیز بررسی شود. نوع ماده کنترلی، ژنوتیپ‌های موجود در آن و معیار پذیرش سیگنال میان کیت‌های HPV یکسان نیست؛ به همین دلیل تفسیر نتیجه باید بر پایه دستورالعمل سازنده انجام گیرد.
کنترل مثبت چگونه صحت عملکرد واکنش PCR را تأیید می‌کند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV از طریق ایجاد یک نتیجه از پیش قابل پیش‌بینی، امکان ارزیابی عملکرد واکنش PCR را فراهم می‌کند. هنگامی که کنترل مثبت در واکنش قرار می‌گیرد، سیستم باید توالی هدف موجود در آن را تکثیر و سپس سیگنال مربوط به آن را ثبت کند. اگر این فرایند مطابق معیار تعریف‌شده انجام شود، می‌توان نتیجه گرفت که اجزایی مانند Master Mix، پرایمرها، پروب‌ها، آنزیم و برنامه حرارتی دستگاه حداقل در سطح مورد انتظار عمل کرده‌اند. عدم ایجاد پاسخ مناسب می‌تواند نشان‌دهنده اختلال در یک یا چند مرحله باشد و باید قبل از پذیرش Run، علت آن مشخص شود.
رعایت اصول کنترل کیفیت در تمام آزمون‌های مولکولی، از جمله بررسی جهش‌های ژنتیکی، اهمیت دارد. برای نمونه، هنگام استفاده از کیت Factor II G20210A برند Zena Max نیز باید کنترل‌های تعریف‌شده و معیارهای پذیرش نتایج مطابق دستورالعمل همان محصول بررسی شوند.
در کنترل مثبت HPV چه سیگنالی باید مشاهده شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV برای Positive Control یک الگوی پاسخ مشخص دارند که به طراحی کیت و کانال‌های فلورسانس دستگاه وابسته است. در یک آزمایش Real-Time PCR ممکن است کنترل مثبت حاوی یک یا چند توالی مربوط به HPV باشد و در نتیجه باید در کانال‌های تعیین‌شده سیگنال amplification ایجاد شود. برخی کیت‌ها علاوه بر اهداف HPV، توالی مربوط به Internal Control را نیز در کنترل مثبت قرار می‌دهند. بنابراین نمی‌توان یک الگوی سیگنال واحد را برای تمام محصولات تعیین کرد. معیار صحیح، بررسی جدول تفسیر کنترل‌ها و محدوده‌های پذیرش درج‌شده در IFU همان محصول است.
اگر کنترل مثبت HPV نتیجه ندهد چه معنایی دارد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV هنگامی که Positive Control پاسخ مورد انتظار ایجاد نمی‌کند، هشداری درباره احتمال بروز اشکال در Run محسوب می‌شود. این وضعیت می‌تواند ناشی از آماده‌سازی نادرست Master Mix، فراموش شدن افزودن یک جزء، خرابی معرف‌ها، انتخاب برنامه نامناسب دستگاه، خطای پیپتاژ یا شرایط نگهداری نامطلوب مواد باشد. در چنین شرایطی نباید نبودن سیگنال را صرفاً به دستگاه نسبت داد. لازم است تمام مراحل اجرا از آماده‌سازی تا تنظیم کانال‌های تشخیص بررسی شوند. تصمیم درباره تکرار کامل آزمایش یا بخشی از فرایند باید طبق دستورالعمل سازنده کیت و رویه کنترل کیفیت آزمایش HPV در آزمایشگاه انجام شود.
دلایل نامعتبر شدن کنترل مثبت در تست HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV ممکن است در اثر مجموعه‌ای از خطاهای پیش‌تحلیلی و تحلیلی از محدوده مورد انتظار خارج شوند. استفاده از مواد منقضی یا چندبار منجمد و ذوب‌شده، آماده‌سازی نادرست واکنش، حجم‌برداری اشتباه، اختلاط ناکافی، قرار دادن کنترل در چاهک نامناسب و انتخاب پروفایل حرارتی اشتباه از جمله دلایل قابل بررسی هستند. همچنین خرابی یا کالیبراسیون نامناسب دستگاه می‌تواند بر ثبت فلورسانس اثر بگذارد. برای یافتن علت اصلی بهتر است خطا به‌صورت مرحله‌ای بررسی شود و به‌جای تکرار بدون بررسی Run، ابتدا مشخص شود نقص احتمالی از مواد، اپراتور، تجهیزات یا تنظیمات نرم‌افزاری ناشی شده است.
عملکرد نامناسب کنترل‌های آزمایشگاهی ممکن است اعتبار نتایج یک نوبت آزمایش HPV را تحت تأثیر قرار دهد. در چنین شرایطی، بررسی علت خطا و تصمیم‌گیری درباره تکرار آزمایش ضروری است. برای آشنایی با دلایل گزارش نتایج نامعتبر و روش‌های پیگیری آن، راهنمای علت نتیجه Invalid در آزمایش HPV چیست؟ را بخوانید.
کنترل منفی در آزمایش HPV چگونه عمل می‌کند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در بخش Negative Control نقش مهمی در آشکار کردن آلودگی احتمالی دارند. این کنترل به‌طور معمول نباید حاوی توالی هدف HPV مورد بررسی باشد؛ بنابراین در کانال اختصاصی ویروس انتظار ایجاد سیگنال مثبت وجود ندارد. اگر DNA هدف به‌صورت ناخواسته وارد کنترل منفی شود، سیستم می‌تواند amplification را ثبت کند و آزمایشگاه را نسبت به احتمال contamination هشدار دهد. این اتفاق ممکن است هنگام آماده‌سازی مواد، باز کردن لوله‌های حاوی محصول PCR، استفاده از تجهیزات آلوده یا انتقال قطرات بسیار کوچک میان نمونه‌ها رخ دهد. به همین دلیل نتیجه کنترل منفی باید همراه با الگوی سایر نمونه‌ها، موقعیت چاهک‌ها و معیارهای پذیرش اختصاصی کیت ارزیابی شود.
کنترل منفی چگونه آلودگی آزمایش را مشخص می‌کند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV برای شناسایی contamination از یک اصل ساده استفاده می‌کنند: ماده‌ای که فاقد هدف HPV است نباید برای آن هدف سیگنال ایجاد کند. اگر در Negative Control تکثیر اختصاصی مشاهده شود، احتمال ورود DNA هدف به یکی از مراحل کار مطرح می‌شود. آلودگی می‌تواند از نمونه‌های با بار بالا، کنترل مثبت، محصولات تکثیرشده قبلی یا سطوح و ابزارهای آزمایشگاه منشأ بگیرد. بررسی کنترل منفی به‌خصوص در روش‌های مبتنی بر amplification اهمیت بالایی دارد، زیرا مقدار بسیار کمی از ماده ژنتیکی ناخواسته نیز ممکن است تکثیر شود و نتیجه گمراه‌کننده ایجاد کند.
آیا در کنترل منفی HPV باید سیگنال مشاهده شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV الزاماً به این معنا نیستند که Negative Control در تمام کانال‌های دستگاه هیچ سیگنالی نداشته باشد. در کانال اختصاصی هدف HPV معمولاً انتظار می‌رود سیگنال هدف مشاهده نشود؛ اما برخی کیت‌ها کنترل منفی را به شکلی طراحی کرده‌اند که حاوی توالی Internal Control است. در این محصولات ممکن است سیگنال کنترل داخلی به‌طور طبیعی دیده شود و در عین حال کانال HPV منفی باقی بماند. بنابراین تعبیر «هیچ Ct نباید وجود داشته باشد» برای همه کیت‌ها صحیح نیست. تفسیر دقیق باید بر اساس طراحی assay و جدول پذیرش کنترل‌ها در دستورالعمل محصول انجام گیرد.
مثبت شدن کنترل منفی HPV نشانه چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در صورت ایجاد سیگنال اختصاصی HPV در Negative Control می‌توانند وجود آلودگی احتمالی را مطرح کنند. منشأ این آلودگی ممکن است انتقال تصادفی مقدار کمی DNA از کنترل مثبت یا نمونه‌های قوی، آلودگی نوک سمپلر، سطوح کار، لوله‌ها یا معرف‌ها باشد. همچنین خطا در جانمایی نمونه‌ها و وارد کردن مشخصات چاهک‌ها در نرم‌افزار باید بررسی شود. شدت و شکل منحنی amplification نیز می‌تواند اطلاعات تکمیلی ارائه دهد. با این حال، معیار نهایی پذیرش یا رد Run باید مطابق الزامات کیت باشد و نباید صرفاً بر اساس یک مشاهده بدون بررسی تصمیم‌گیری شود.
در صورت مثبت شدن کنترل منفی چه اقدامی باید انجام شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV زمانی که Negative Control نتیجه غیرمنتظره نشان می‌دهد، نیازمند بررسی سیستماتیک فرایند هستند. نخست باید صحت جانمایی کنترل‌ها، نام‌گذاری چاهک‌ها و منحنی‌های amplification کنترل شود. سپس احتمال آلودگی محیط، سمپلرها، رک‌ها، محل آماده‌سازی Master Mix و معرف‌های استفاده‌شده ارزیابی شود. جداسازی نواحی Pre-PCR و Post-PCR و تعویض مواد یا اقلام مشکوک می‌تواند بخشی از فرایند رفع اشکال باشد. در بسیاری از سیستم‌ها، نامعتبر بودن کنترل منفی باعث رد Run و لزوم پردازش مجدد نمونه‌ها می‌شود، اما نحوه دقیق اقدام باید از IFU کیت استخراج شود.
تفاوت کنترل مثبت، کنترل منفی و کنترل داخلی در آزمایش HPV
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV با Internal Control اهداف یکسانی ندارند و نباید این سه مفهوم به جای یکدیگر استفاده شوند. Positive Control عمدتاً نشان می‌دهد سیستم قادر به شناسایی هدف مشخص است، در حالی که Negative Control برای آشکار کردن آلودگی یا ایجاد سیگنال ناخواسته به کار می‌رود. کنترل داخلی معمولاً برای ارزیابی صحت پردازش یک نمونه، کفایت ماده مورد آزمایش یا وجود عوامل مهارکننده amplification طراحی می‌شود. نوع و محل قرارگیری Internal Control در کیت‌های مختلف متفاوت است؛ برای مثال ممکن است همراه هر نمونه بررسی شود. در نتیجه، اعتبارسنجی یک Run و اعتبار یک نمونه منفرد دو سطح متفاوت از کنترل کیفیت هستند که باید جداگانه تفسیر شوند.
رعایت اصول کنترل کیفیت در تمام آزمون‌های تشخیص مولکولی ضروری است و تنها به آزمایش HPV محدود نمی‌شود. در محصولاتی مانند کیت تشخیص HLA-B51 برند Zena Max نیز بررسی کنترل‌های معتبر، کیفیت DNA و عملکرد دستگاه Real-Time PCR به جلوگیری از گزارش نتایج نادرست کمک می‌کند.
تفاوت Positive Control و Negative Control در تست HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV از نظر نتیجه مورد انتظار درست در نقطه مقابل یکدیگر قرار دارند. Positive Control باید پاسخ تعیین‌شده توسط سازنده را ایجاد کند تا توانایی سیستم در شناسایی هدف تأیید شود؛ اما Negative Control برای هدف HPV نباید پاسخ مثبت ناخواسته داشته باشد. به زبان ساده، یکی بررسی می‌کند سیستم در صورت وجود هدف قادر به تشخیص آن هست یا خیر و دیگری بررسی می‌کند آیا سیستم در نبود هدف، اشتباهاً سیگنال ایجاد می‌کند یا آلوده شده است. ارزیابی هم‌زمان این دو وضعیت تصویر دقیق‌تری از کیفیت اجرای Run ارائه می‌دهد.
تفاوت کنترل داخلی با کنترل مثبت HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV با کنترل داخلی از نظر هدف ارزیابی متفاوت هستند. Positive Control یک نمونه شناخته‌شده است که برای اطمینان از عملکرد assay در سطح Run مورد استفاده قرار می‌گیرد، اما Internal Control معمولاً همراه نمونه یا درون فرایند آن بررسی می‌شود تا مشخص شود پردازش نمونه و amplification تحت شرایط قابل قبول انجام شده است. در برخی سیستم‌ها کنترل داخلی همچنین می‌تواند وجود مهارکننده‌های PCR یا ناکافی بودن ورودی سلولی را آشکار کند. بنابراین مشاهده Positive Control مناسب به‌تنهایی تضمین نمی‌کند که تک‌تک نمونه‌های بیمار نیز بدون مشکل پردازش شده باشند.
تفاوت کنترل داخلی با کنترل منفی HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در مقایسه با Internal Control اطلاعات متفاوتی درباره منبع خطا ارائه می‌کنند. Negative Control عمدتاً برای بررسی آلودگی و ایجاد سیگنال هدف در نمونه‌ای که نباید HPV داشته باشد استفاده می‌شود، در حالی که کنترل داخلی وضعیت پردازش یا قابلیت amplification را در نمونه مورد نظر ارزیابی می‌کند. ممکن است Run از نظر کنترل منفی کاملاً قابل قبول باشد، اما کنترل داخلی یک نمونه خاص خارج از محدوده قرار گیرد. چنین حالتی نشان می‌دهد مشکل الزاماً عمومی نیست و می‌تواند به همان نمونه، استخراج یا وجود مهارکننده مربوط باشد.
چرا وجود کنترل داخلی جای کنترل مثبت و منفی را نمی‌گیرد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV جنبه‌هایی از کیفیت Run را بررسی می‌کنند که Internal Control به‌تنهایی قادر به پوشش کامل آن‌ها نیست. کنترل داخلی ممکن است نشان دهد یک نمونه به‌درستی پردازش شده یا amplification در آن مهار نشده است، اما لزوماً ثابت نمی‌کند که هیچ آلودگی میان نمونه‌ها رخ نداده یا همه معرف‌های مربوط به هدف HPV عملکرد مورد انتظار داشته‌اند. به همین دلیل سیستم‌های معتبر کنترل کیفیت معمولاً چند سطح کنترل را در کنار یکدیگر به کار می‌گیرند. ترکیب این اطلاعات امکان تشخیص دقیق‌تر منشأ خطا و جلوگیری از گزارش نتایج غیرقابل اعتماد را فراهم می‌کند.
کنترل مثبت و منفی چگونه اعتبار نتیجه آزمایش HPV را مشخص می‌کنند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV مانند نقاط مرجع یک Run عمل می‌کنند و نشان می‌دهند آیا شرایط لازم برای پذیرش نتایج فراهم شده است یا خیر. در حالت مطلوب، Positive Control باید معیارهای از پیش تعیین‌شده برای شناسایی هدف را برآورده کند و Negative Control نیز از نظر HPV فاقد سیگنال غیرمجاز باشد. اگر یکی از این شرایط برقرار نباشد، نمی‌توان صرفاً به نتایج نمونه‌های بالینی اتکا کرد. اهمیت این موضوع زمانی بیشتر می‌شود که تعداد زیادی نمونه به‌صورت هم‌زمان پردازش شده باشند، زیرا نقص یک Run می‌تواند بر چندین نتیجه اثر بگذارد. معیار Pass یا Fail باید از پروتکل معتبر و دستورالعمل همان روش استخراج شود.
چه زمانی Run آزمایش HPV معتبر است؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV زمانی از اعتبار Run حمایت می‌کنند که هر دو طبق محدوده‌های تعریف‌شده برای همان assay نتیجه قابل قبول داشته باشند. Positive Control باید سیگنال یا الگوی مورد انتظار را ایجاد کند و Negative Control نیز نباید شواهدی از حضور غیرمجاز HPV نشان دهد. علاوه بر این، نرم‌افزار بعضی دستگاه‌ها معیارهای دیگری مانند کیفیت منحنی، محدوده Ct یا وضعیت Internal Control را نیز در ارزیابی وارد می‌کند. بنابراین معتبر بودن Run یک تصمیم چندعاملی است و نباید تنها بر پایه وجود یا نبود یک عدد Ct گرفته شود.
چه زمانی نتیجه نمونه بیمار قابل گزارش نیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV می‌توانند شرایطی را مشخص کنند که در آن نتایج نمونه‌ها نباید مستقیماً گزارش شوند. اگر Run به دلیل شکست Positive Control یا آلودگی Negative Control نامعتبر شناخته شود، نتایج مربوط به نمونه‌های همان اجرا ممکن است قابل اتکا نباشند. علاوه بر این، حتی در یک Run معتبر نیز امکان دارد یک نمونه خاص به دلیل نامعتبر بودن Internal Control یا مشکل در پردازش نیاز به تکرار داشته باشد. تصمیم نهایی باید مطابق الگوریتم تفسیر کیت انجام شود تا از گزارش مثبت یا منفی کاذب جلوگیری شود.
اگر یکی از کنترل‌ها نامعتبر باشد آیا نتایج نمونه‌ها معتبر هستند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV باید به‌صورت یک مجموعه ارزیابی شوند و نامعتبر شدن یکی از آن‌ها می‌تواند اعتبار کل Run را تحت تأثیر قرار دهد. برای مثال، شکست Positive Control ممکن است نشان دهد سیستم توان شناسایی هدف را به شکل قابل اعتماد نشان نداده است، در حالی که مثبت شدن Negative Control احتمال contamination را مطرح می‌کند. در بسیاری از کیت‌های تشخیصی، چنین شرایطی باعث Invalid شدن Run می‌شود. با این حال، نحوه برخورد دقیق ممکن است میان پلتفرم‌ها متفاوت باشد و باید از قوانین اعتبارسنجی اختصاصی محصول استفاده شود.
آیا در صورت خطای کنترل‌ها باید آزمایش HPV تکرار شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در صورت خارج شدن از معیار پذیرش معمولاً نیاز به انجام اقدامات اصلاحی و سپس تکرار بخش تعیین‌شده از فرایند ایجاد می‌کنند. اینکه تکرار از مرحله amplification آغاز شود یا نمونه‌ها از مرحله آماده‌سازی و استخراج مجدداً پردازش شوند، به نوع سیستم و علت خطا بستگی دارد. برای نمونه، اگر شواهدی از آلودگی گسترده وجود داشته باشد، صرف تکرار PCR با همان مواد ممکن است مشکل را برطرف نکند. ابتدا باید منشأ نقص شناسایی و اصلاح شود و سپس روش تکرار مطابق دستورالعمل سازنده انتخاب گردد.
دلایل خطا در کنترل مثبت و منفی آزمایش HPV چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV ممکن است تحت تأثیر عوامل متعددی قرار گیرند که از خطاهای ساده اپراتوری تا مشکلات معرف‌ها و تجهیزات متغیر هستند. بسیاری از خطاها در مرحله آماده‌سازی اتفاق می‌افتند؛ جایی که حجم‌های کم مواد و حساسیت بالای PCR احتمال بروز اشتباه را افزایش می‌دهد. شرایط نامناسب نگهداری، آلودگی متقاطع، استفاده نادرست از نوک سمپلر، مخلوط نکردن کافی مواد، تنظیم اشتباه کانال‌های فلورسانس و اجرای پروتکل حرارتی نامناسب از موارد قابل بررسی هستند. برای Troubleshooting مؤثر بهتر است زمان بروز خطا، شکل منحنی‌ها، وضعیت سایر کنترل‌ها و سابقه Runهای قبلی نیز در کنار هم ارزیابی شوند.
آلودگی نمونه یا محیط آزمایشگاه
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV نسبت به آلودگی DNA بسیار حساس هستند، زیرا روش PCR قادر است مقادیر کم ماده ژنتیکی را نیز تکثیر کند. باز شدن لوله‌های حاوی amplicon در فضای آماده‌سازی واکنش، استفاده مشترک از تجهیزات آلوده، پاشش قطرات بسیار کوچک هنگام پیپتاژ یا انتقال DNA از نمونه با بار بالا می‌تواند سبب contamination شود. طراحی جریان کار یک‌طرفه، تفکیک محیط Pre-PCR و Post-PCR، استفاده از نوک‌های فیلتر‌دار و پاک‌سازی مناسب سطوح از راهکارهای مهم کاهش این خطر هستند.
خطای پیپتاژ و آماده‌سازی واکنش
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV ممکن است در اثر برداشت حجم اشتباه یا اضافه نشدن یکی از اجزای لازم نتیجه غیرمنتظره ایجاد کنند. در واکنش‌هایی با حجم کم، حتی اختلاف محدود در مقدار Master Mix یا کنترل می‌تواند بر کیفیت amplification اثر بگذارد. استفاده از سمپلر مناسب محدوده حجمی، کنترل دوره‌ای کالیبراسیون، تعویض نوک بین مواد و رعایت ترتیب افزودن اجزا احتمال خطا را کاهش می‌دهد. همچنین ثبت مرحله‌به‌مرحله فرایند می‌تواند هنگام بررسی Run نامعتبر به شناسایی محل احتمالی اشتباه کمک کند.
مشکل در Master Mix یا سایر مواد مصرفی
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV به کیفیت معرف‌های واکنش وابسته هستند و تغییر در شرایط آن‌ها می‌تواند الگوی کنترل‌ها را مختل کند. قرار گرفتن طولانی‌مدت مواد حساس در دمای نامناسب، استفاده پس از تاریخ تعیین‌شده، آلودگی محلول‌ها یا چرخه‌های متعدد Freeze-Thaw ممکن است عملکرد آنزیم، پرایمر یا پروب را کاهش دهد. تغییر ناگهانی رفتار چند Run متوالی پس از باز کردن یک Lot جدید نیز باید مورد توجه قرار گیرد. در چنین شرایطی بررسی شماره Lot، شرایط حمل، نحوه نگهداری و سوابق کنترل کیفیت می‌تواند در یافتن علت مؤثر باشد.
نگهداری نامناسب یا منقضی شدن مواد کنترل
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV باید دقیقاً مطابق دمای نگهداری و شرایط ذکرشده توسط تولیدکننده نگهداری شوند. مواد کنترلی ممکن است نسبت به تغییرات دما، نور یا تعداد دفعات انجماد و ذوب حساس باشند و کاهش پایداری آن‌ها به نتایج غیرمنتظره منجر شود. بهتر است تاریخ باز شدن ویال، تعداد دفعات استفاده و شرایط فریزر یا یخچال قابل ردیابی باشد. استفاده از مواد خارج از محدوده پایداری تعریف‌شده می‌تواند تشخیص علت یک Run نامعتبر را دشوار کند و احتمال تکرار غیرضروری نمونه‌ها را افزایش دهد.
تنظیمات نادرست دستگاه Real-Time PCR
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV تنها زمانی به‌درستی خوانده می‌شوند که دستگاه با پروتکل سازگار با کیت تنظیم شده باشد. انتخاب اشتباه کانال فلورسانس، دمای Annealing نامناسب، تعداد چرخه‌های متفاوت، Threshold نادرست یا انتخاب پروفایل اشتباه می‌تواند بر تشخیص سیگنال تأثیر بگذارد. علاوه بر تنظیمات نرم‌افزاری، وضعیت اپتیک دستگاه و انجام سرویس یا کالیبراسیون طبق برنامه نیز اهمیت دارد. اگر هم‌زمان چند کنترل و نمونه رفتار غیرعادی نشان دهند، بررسی تنظیمات Run و سوابق دستگاه یکی از مراحل منطقی Troubleshooting است.
وجود مهارکننده‌های PCR چه تأثیری بر نتیجه دارد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV مستقیماً همه موارد مهار PCR در نمونه بیمار را نشان نمی‌دهند و به همین دلیل Internal Control اهمیت پیدا می‌کند. موادی که همراه نمونه وارد استخراج یا واکنش می‌شوند ممکن است فعالیت آنزیم را کاهش دهند و مانع amplification مطلوب شوند. در چنین حالتی امکان دارد کنترل‌های Run کاملاً معتبر باشند اما یک نمونه نتیجه Invalid داشته باشد. بررسی Internal Control می‌تواند در تفکیک مشکل اختصاصی نمونه از نقص عمومی Run مفید باشد و از تفسیر اشتباه عدم تکثیر به‌عنوان نتیجه منفی جلوگیری کند.
Ct کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV چگونه تفسیر می‌شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در روش Real-Time PCR ممکن است بر اساس Ct یا شاخص مشابه دیگری ارزیابی شوند، اما این اعداد تنها زمانی معنا دارند که با معیارهای همان کیت مقایسه شوند. Ct نشان‌دهنده چرخه‌ای است که در آن سیگنال amplification از آستانه تعیین‌شده عبور می‌کند و مقدار آن تحت تأثیر غلظت هدف، کارایی واکنش و تنظیمات assay قرار دارد. از آنجا که ترکیب کنترل‌ها و روش تحلیل میان محصولات مختلف متفاوت است، تعیین یک عدد عمومی به‌عنوان Ct استاندارد برای همه کیت‌های HPV صحیح نیست. آزمایشگاه باید محدوده پذیرش اعلام‌شده توسط سازنده و کنترل‌های کیفی داخلی خود را ملاک قرار دهد.
Ct کنترل مثبت HPV باید در چه محدوده‌ای باشد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV برای Positive Control محدوده‌ای وابسته به طراحی هر کیت دارند و نمی‌توان یک بازه ثابت مانند یک عدد مشخص را برای همه تست‌ها ارائه کرد. مقدار هدف ژنتیکی موجود در کنترل، نوع دستگاه، ترکیب Master Mix، Threshold نرم‌افزار و طراحی پرایمر و پروب همگی بر Ct تأثیر می‌گذارند. اگر سازنده محدوده مجاز یا Cut-off مشخصی تعیین کرده باشد، نتیجه باید با همان معیار مقایسه شود. تغییر پایدار Ct نسبت به الگوی معمول آزمایشگاه نیز می‌تواند ارزش بررسی داشته باشد، حتی اگر هنوز در محدوده پذیرش رسمی قرار گرفته باشد.
آیا کنترل منفی باید Ct داشته باشد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در Negative Control معمولاً نباید برای هدف اختصاصی ویروس Ct مثبت قابل قبول ایجاد کنند، زیرا این کنترل فاقد توالی هدف مورد انتظار است. با این حال، اگر کیت دارای Internal Control باشد ممکن است برای کانال کنترل داخلی Ct ثبت شود. به همین دلیل مشاهده یک عدد Ct بدون مشخص کردن کانال مربوطه برای قضاوت کافی نیست. آزمایشگر باید تشخیص دهد سیگنال به HPV، کنترل داخلی یا یک فلوروفور دیگر مربوط است و سپس نتیجه را بر اساس جدول تفسیر رسمی assay ارزیابی کند.
Ct غیرطبیعی کنترل مثبت نشانه چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV اگر برای Positive Control تغییر قابل توجهی نسبت به الگوی مورد انتظار نشان دهند، می‌توانند نشانه‌ای برای بررسی کارایی واکنش باشند. Ct دیرتر از حد تعیین‌شده ممکن است با کاهش کیفیت مواد، خطای حجم‌برداری، افت غلظت کنترل یا عملکرد ناکافی دستگاه ارتباط داشته باشد. Ct غیرمعمول زودرس نیز باید در بستر طراحی assay و احتمال اشتباه در آماده‌سازی بررسی شود. یک نتیجه منفرد نباید بدون توجه به معیارهای سازنده و روند کنترل کیفیت آزمایشگاه تفسیر شود، زیرا تغییرات محدود میان Runها ممکن است طبیعی باشند.
چرا محدوده Ct کنترل‌ها در کیت‌های مختلف متفاوت است؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در محصولات گوناگون با غلظت، ترکیب و اهداف مولکولی یکسان طراحی نمی‌شوند و همین مسئله سبب تفاوت Ct مورد انتظار می‌شود. یک کیت ممکن است ژن E7 را هدف قرار دهد، محصول دیگر بخش دیگری از ژنوم را بررسی کند و پلتفرم‌های مختلف نیز از شیمی و سیستم اپتیکی متفاوت استفاده کنند. حتی نحوه تعیین Threshold می‌تواند بر عدد نهایی اثر بگذارد. بنابراین مقایسه مستقیم Ct کنترل دو برند بدون درنظر گرفتن روش و IFU آن‌ها از نظر فنی صحیح نیست و می‌تواند به برداشت اشتباه از کیفیت تست منجر شود.
اگر کنترل مثبت یا منفی آزمایش HPV نامعتبر باشد چه کنیم؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV وقتی خارج از معیار پذیرش قرار می‌گیرند، ابتدا باید به‌عنوان نشانه یک مشکل قابل بررسی در فرایند تلقی شوند، نه اینکه بلافاصله یک علت مشخص به آن‌ها نسبت داده شود. بررسی باید از موارد ساده مانند جانمایی لوله‌ها، نام‌گذاری نمونه‌ها و تنظیمات نرم‌افزار آغاز شود و سپس به شرایط مواد، آلودگی احتمالی، عملکرد دستگاه و مراحل آماده‌سازی برسد. ثبت دقیق جزئیات Run امکان مقایسه با آزمایش‌های قبلی را فراهم می‌کند. پس از شناسایی و اصلاح علت، تصمیم درباره تکرار کنترل‌ها یا پردازش مجدد نمونه‌ها باید مطابق دستورالعمل کیت اتخاذ شود.
بررسی تنظیمات دستگاه و نرم‌افزار PCR
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در صورت بروز خطای غیرمنتظره باید همراه با اطلاعات Run در نرم‌افزار بررسی شوند. انتخاب کیت صحیح، پروفایل حرارتی، کانال‌های Fluorescence، Threshold و نام‌گذاری صحیح چاهک‌ها از مواردی هستند که باید کنترل شوند. گاهی واکنش از نظر آزمایشگاهی درست انجام شده اما انتخاب تنظیمات نادرست سبب تفسیر اشتباه داده‌ها شده است. مشاهده منحنی‌های خام amplification و مقایسه آن‌ها با Runهای معتبر قبلی می‌تواند به تشخیص چنین شرایطی کمک کند. هر تغییر دستی در تنظیمات تحلیل نیز باید با الزامات سازنده سازگار باشد.
بررسی تاریخ انقضا و شرایط نگهداری کیت
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV ممکن است در صورت استفاده از معرف‌هایی که شرایط نگهداری آن‌ها رعایت نشده است رفتار غیرعادی نشان دهند. دمای فریزر یا یخچال، مدت باقی ماندن مواد در دمای اتاق، تاریخ باز شدن و تعداد Freeze-Thaw از جمله اطلاعاتی هستند که باید بررسی شوند. تاریخ انقضا به‌تنهایی تمام مسئله نیست؛ ماده‌ای که هنوز منقضی نشده اما خارج از شرایط توصیه‌شده نگهداری شده است نیز ممکن است کارایی مطلوب نداشته باشد. مستندسازی زنجیره نگهداری به پیشگیری از چنین خطاهایی کمک می‌کند.
بررسی احتمال آلودگی مواد و محیط
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در صورت ایجاد سیگنال HPV در Negative Control نیازمند بررسی دقیق احتمال contamination هستند. پاک‌سازی فضای کار، تعویض دستکش، بررسی سمپلرها، استفاده از نوک‌های فیلتر‌دار جدید و ارزیابی مواد مشترک میان واکنش‌ها از اقدامات قابل انجام هستند. در صورت امکان باید مشخص شود آیا آلودگی تنها به یک موقعیت محدود است یا الگوی گسترده‌تری در پلیت دیده می‌شود. وجود یک نمونه بسیار قوی در چاهک مجاور نیز می‌تواند هنگام بررسی الگوی رخداد مورد توجه قرار گیرد.
چه زمانی Run آزمایش HPV باید تکرار شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV زمانی می‌توانند به تکرار Run منجر شوند که معیارهای اعتبارسنجی مشخص‌شده توسط سازنده برآورده نشده باشند. شکست Positive Control، وجود سیگنال غیرمجاز در Negative Control یا Flagهای کنترل کیفیت از جمله موقعیت‌هایی هستند که ممکن است Run را Invalid کنند. با این حال، تکرار نباید پیش از بررسی علت انجام شود؛ زیرا اگر منشأ مشکل همچنان باقی مانده باشد، Run جدید نیز ممکن است نامعتبر شود. مسیر تکرار باید بر اساس نوع خطا، مرحله درگیر و پروتکل آزمایشگاه انتخاب شود.
چه زمانی باید از کنترل یا کیت جدید استفاده کرد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV اگر پس از بررسی شرایط اجرا همچنان نتایج غیرقابل قبول ایجاد کنند، ممکن است نیاز به جایگزینی ماده کنترلی یا معرف‌های مشکوک وجود داشته باشد. آسیب ناشی از نگهداری نامناسب، آلودگی ویال، انقضا یا مشکل یک Lot از مواردی هستند که باید مدنظر قرار گیرند. استفاده از یک ویال جدید می‌تواند در تفکیک خطای ماده از سایر عوامل کمک‌کننده باشد. هرگونه تصمیم درباره تغییر Lot یا باز کردن کیت جدید بهتر است ثبت شود تا امکان ردیابی نتیجه اقدامات اصلاحی وجود داشته باشد.
آیا همه کیت‌های HPV کنترل مثبت و منفی دارند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV در بسیاری از کیت‌های مولکولی تجاری به‌عنوان بخشی از سیستم کنترل کیفیت ارائه می‌شوند، اما شکل ارائه، ترکیب و نحوه استفاده آن‌ها می‌تواند متفاوت باشد. برای مثال، برخی محصولات ویال‌های جداگانه Positive و Negative Control دارند، در حالی که سیستم‌های دیگر ممکن است کنترل‌ها را به شیوه‌ای متناسب با پلتفرم خود مدیریت کنند. تعداد دفعات استفاده از کنترل‌ها نیز بسته به طراحی دستگاه، Lot معرف و دستورالعمل محصول تغییر می‌کند. بنابراین هنگام مقایسه کیت‌ها صرف وجود عبارت Positive Control کافی نیست و باید مشخص شود کنترل چه مرحله‌ای را ارزیابی می‌کند، چه سیگنالی ایجاد می‌کند و معیار Pass/Fail آن چیست.
کنترل‌های HPV در کیت‌های Real-Time PCR چگونه ارائه می‌شوند؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV ممکن است به‌صورت ویال‌های آماده، مواد لیوفیلیزه یا محلول‌هایی با دستور آماده‌سازی مشخص در بسته کیت قرار گیرند. Positive Control معمولاً حاوی توالی یا توالی‌های هدف تعریف‌شده است و Negative Control به شکلی طراحی می‌شود که فاقد هدف HPV باشد. بعضی سیستم‌ها کنترل داخلی را نیز در همین مواد قرار می‌دهند. نحوه آماده‌سازی، مقدار مصرف و موقعیت قرارگیری آن‌ها در پلیت باید دقیقاً طبق IFU رعایت شود، زیرا تغییر خودسرانه غلظت یا حجم می‌تواند معیارهای اعتبارسنجی را تحت تأثیر قرار دهد.
آیا ساختار کنترل‌ها در همه کیت‌های HPV یکسان است؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV میان تولیدکنندگان مختلف می‌توانند از نظر نوع ماده ژنتیکی، ژنوتیپ‌های هدف، غلظت و وجود Internal Control متفاوت باشند. برای مثال یک Positive Control ممکن است چند ژنوتیپ HPV را هم‌زمان پوشش دهد، در حالی که محصول دیگری از طراحی متفاوتی برای ارزیابی کانال‌های تشخیصی استفاده کند. Negative Control نیز در بعضی سیستم‌ها می‌تواند حاوی توالی کنترل داخلی باشد. به همین علت انتقال قواعد تفسیر یک برند به برند دیگر مناسب نیست و هر کیت باید بر اساس مستندات رسمی خودش ارزیابی شود.
هنگام انتخاب کیت HPV چه مشخصاتی از کنترل‌ها باید بررسی شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV هنگام ارزیابی یک کیت باید از نظر سهولت استفاده، تعریف معیارهای پذیرش و توانایی شناسایی خطاهای مهم بررسی شوند. مشخص بودن ترکیب کنترل، تعداد دفعات مورد نیاز در هر Run، شرایط نگهداری، محدوده پذیرش Ct یا سایر شاخص‌ها و دستور برخورد با نتیجه Invalid از موارد مهم هستند. وجود دستورالعمل شفاف Troubleshooting نیز برای آزمایشگاه ارزش عملی بالایی دارد. علاوه بر کنترل‌ها، اعتبار بالینی assay، ژنوتیپ‌های قابل شناسایی، سازگاری با دستگاه و الزامات نمونه‌گیری نیز باید در تصمیم نهایی لحاظ شوند.
سوالات متداول درباره کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV
آیا مثبت شدن کنترل مثبت به معنی مثبت بودن نمونه بیمار است؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV هیچ ارتباط مستقیمی با مثبت بودن فرد مورد آزمایش ندارند. Positive Control عمداً حاوی ماده هدف مشخص است تا نشان دهد سیستم قادر به شناسایی آن است و بنابراین انتظار می‌رود نتیجه آن مطابق طراحی کیت مثبت باشد. نتیجه نمونه هر بیمار به‌طور مستقل در چاهک یا واکنش مربوط به همان نمونه بررسی می‌شود. در نتیجه، مشاهده سیگنال در Positive Control یک بخش طبیعی از کنترل کیفیت Run محسوب می‌شود و نباید به‌عنوان شواهدی درباره وضعیت ابتلای افراد تفسیر شود.
اگر کنترل منفی مثبت شود نتیجه آزمایش قابل اعتماد است؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV اگر در Negative Control الگوی خارج از محدوده ایجاد کنند، می‌توانند اعتبار Run را زیر سؤال ببرند. مشاهده سیگنال اختصاصی HPV در محلی که نباید هدف وجود داشته باشد احتمال contamination یا خطای فنی را مطرح می‌کند. در بسیاری از سیستم‌های تشخیصی، چنین شرایطی موجب Invalid شدن Run و نیاز به بررسی و تکرار می‌شود. با این حال، معیار دقیق تصمیم‌گیری باید از دستورالعمل assay استخراج شود و نتیجه نمونه‌ها نباید جدا از وضعیت کنترل‌های همان Run تفسیر گردد.
تفاوت کنترل منفی با نمونه HPV منفی چیست؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV مواد مرجعی برای بررسی عملکرد آزمایش هستند، در حالی که نمونه HPV منفی یک نمونه بالینی متعلق به فرد است که هدف مورد بررسی در آن طبق معیار assay شناسایی نشده است. Negative Control از ابتدا با هدف کنترل کیفیت و بررسی آلودگی در Run قرار می‌گیرد و نتیجه مورد انتظار آن از پیش مشخص است. بنابراین کارکرد این دو کاملاً متفاوت است. یک نمونه بیمار منفی درباره وضعیت ماده ژنتیکی HPV در همان نمونه اطلاعات می‌دهد، اما Negative Control درباره کیفیت اجرای آزمایش اطلاعات فراهم می‌کند.
آیا بدون کنترل مثبت می‌توان نتیجه HPV را گزارش کرد؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV باید طبق الزامات تعیین‌شده برای همان روش مورد استفاده قرار گیرند و حذف Positive Control در سیستمی که وجود آن را برای هر Run الزامی می‌داند می‌تواند اعتبار آزمایش را مخدوش کند. بدون یک کنترل معتبر ممکن است مشخص نباشد آیا عدم مشاهده سیگنال در نمونه‌ها ناشی از نبود هدف بوده یا سیستم تشخیصی به‌درستی عمل نکرده است. تعداد و دفعات اجرای کنترل‌ها در همه دستگاه‌ها یکسان نیست؛ بنابراین آزمایشگاه باید پروتکل تأییدشده و IFU محصول را رعایت کند.
آیا کنترل داخلی همان کنترل مثبت است؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV با Internal Control مفاهیم جداگانه‌ای هستند، هرچند ممکن است در یک سیستم برخی توالی‌های کنترلی در کنار یکدیگر قرار گرفته باشند. Positive Control برای تأیید توان سیستم در ایجاد پاسخ مورد انتظار نسبت به هدف تعریف‌شده استفاده می‌شود، اما کنترل داخلی معمولاً پردازش نمونه، کفایت ورودی یا احتمال مهار amplification را ارزیابی می‌کند. به همین علت ممکن است Positive Control یک Run کاملاً معتبر باشد ولی Internal Control یک نمونه خاص با مشکل مواجه شود و همان نمونه نیاز به بررسی جداگانه داشته باشد.
در هر Run آزمایش HPV چند کنترل باید استفاده شود؟
کنترل مثبت و منفی در آزمایش HPV از نظر تعداد و تناوب اجرا به طراحی assay وابسته هستند و نمی‌توان یک عدد ثابت را برای همه کیت‌ها اعلام کرد. برخی سیستم‌ها حداقل یک Positive Control و یک Negative Control را در هر Run الزام می‌کنند، در حالی که پلتفرم‌های خودکار ممکن است قواعد مرتبط با Batch یا Lot داشته باشند. آزمایشگاه نباید تعداد کنترل‌ها را بر اساس یک پروتکل عمومی تعیین کند. دستورالعمل سازنده، الزامات کنترل کیفیت داخلی و استانداردهای قابل اجرا در مجموعه باید مبنای برنامه کنترل قرار گیرند.
